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Los primeros Me 321A-1 producidos, entraron en servicio en mayo de 1941 con el 321 Grossraumlastensegler en Leipheim, inicialmente, remolcados por Ju 90 y posteriormente, por los He 111Z o por tres Bf 110 con la disposición Troikaschlepp.3 La segunda y última variante producida del planeador , el Me 321B-1 tenía una tripulación de 3 miembros y estaba armado con 4 ametralladoras MG 15 de 7,92 mm. El Me 321 fue poco usado en el frente este por las siguientes razones: Al ser un planeador, el Me 321 carecía de la posibilidad de realizar un segundo o sucesivos acercamientos a una pista de aterrizaje que estuviese ocupada en un primer acercamiento. Era imposible de mover en tierra si se carecía de los vehículos especializados para ello, debido a su gran tamaño, carencia de un tren de aterrizaje propio, y no disponer de ningún tipo de automoción. Antes de la introducción del He 111 Zwilling la peligrosa disposición Troikaschlepp le daba un alcance de un único recorrido de sólo 400 km la cual, que era insuficiente para operar con seguridad.4 En la primavera de 1942 los Me 321 fueron retirados del servicio en la Unión Soviética en anticipación a la planificación de la Operación Herkules, la planeada invasión de Malta por los alemanes, en la cual, se utilizaría una flota de planeadores remolcados por He 111Z. Finalmente, el plan, fue abandonado por la falta de aviones remolcadores. En 1943 los Me 321 retornaron a Rusia para participar en la proyectada operación para relevar al General Paulus y al ejército sitiado en Stalingrado, pero en el momento de realizar la operación, no había campos de vuelo adecuados, por lo que fueron reenviados de vuelta a Alemania. Tras la cancelación de la operación de Stalingrado, los planeadores Me 321 fueron puesto en reserva o desguazados, aunque algunos de ellos, fueron transformados en una variante motorizada, el Me 323. Otra operación rechazada debido a la carencia de campos de aterrizaje adecuados, fue la posibilidad de usar los Me 321 que aún permanecían en servicio para transportar tropas hasta la isla de Sicilia. La variante motorizada, el Me 323 Finalmente, la variante motorizada del Me 321, el Me 323 que usaba seis motores Gnome GR14R radial de Cv. (895 kW), y disponía de un tren de aterrizaje fijo de 10 ruedas. Fue el mayor avión de carga con base en tierra de la Segunda Guerra Mundial.
