Вестерн Блот

Вестерн-блоттинг — золотой стандарт для обнаружения и характеристики белков. В основном его используют для идентификации конкретного белка в сложной смеси, ведь метод позволяет определить его молекулярную массу. Также он известен как белковый иммуноблот, так как для специфического обнаружения искомого белка используются антитела. Метод был предложен в 1979 году группой ученых из Швейцарии (Г. Таубин, Т. Стехлин, Дж. Гордон). «Западное» название ему было дано несколько позднее, в 1981 году, У. Нейлом Барнеттом по аналогии с саузерн-блоттингом — методом для изучения ДНК, который был назван в честь разработавшего его британского ученого Эдвина Саузерна. Существуют еще и нозерн-блоттинг для определения РНК, и истерн-блоттинг для характеристики пострансляционных модификаций белков — ни одна сторона света не осталась без внимания молекулярных биологов. Методика проведения вестерн-блоттинга состоит из нескольких этапов: разделение белков по размеру, перенос на твердую подложку и идентификация целевого белка [1]. 1) Белки в составе изучаемого образца разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. На этом этапе под воздействием электрического поля белки мигрируют в геле и разделяются по размеру и заряду. Если на этом этапе провести окраску геля, они будут визуализироваться в виде набора полос. 2) Далее белки переносятся на твердую подложку, обычно на мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (ПВДФ), также под воздействием электрического поля. Данный процесс как раз и называется блоттингом. Во время этой процедуры гель и мембрану помещают в устройство для переноса между двумя листами фильтровальной бумаги. При этом белки на мембране сохраняют свои относительные положения, полосы расположены так же, как в геле. Часто после переноса проводят окрашивание общего белка красителями, например кумасси R-250, Понсо S или другими, для контроля успешности переноса. 3) Чтобы предотвратить неспецифическое связывание первичных и вторичных антител с мембраной, проводят блокирование мембраны. В большинстве случаев для этого используют обезжиренное сухое молоко или раствор бычьего сывороточного альбумина. Кроме того, существует множество коммерческих блокирующих буферов. 4) Наконец, мембрану инкубируют с первичным антителом, специфичным в отношении искомого белка. А потом добавляют меченые вторичные антитела, специфичные к первичным антителам, что позволяет косвенно визуализировать изучаемый белок. Как правило, вторичные антитела ковалентно соединены с ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза), которые образуют окрашенный осадок при взаимодействии с хромогенным субстратом. В результате на мембране можно увидеть видимую цветную полосу в том месте, где первичное антитело связано с белком, и определить его молекулярную массу.